《座头市二段斩》的剧情发生在1965年的日本。影片开篇，座头市，一位身怀绝技的盲剑客，突遭暴徒袭击，他冷静应对，斩杀一人，重伤另一人。厌倦了血腥的旅程，座头市决定拜访曾经的师傅彦辰文及其女儿小代。然而，他发现彦辰文已遇害，小代则被迫成为驿站老板辰五郎的女仆，改名锦木。

为了解真相，座头市潜入驿站，从锦木口中得知，彦辰文曾带着三百两黄金前往京都，欲获得暗马最高等级，却在途中遭人杀害，钱财被夺。辰五郎更是以善意之名，借出一百两，实则强占锦木。

随后，座头市卷入了一系列错综复杂的江湖恩怨中，他凭借过人的武艺和智谋，终于揭露了辰五郎和矶田幸右卫门的阴谋。在一场惊心动魄的决斗中，座头市施展了绝技“二段斩”，将辰五郎和矶田双双击败，为师傅和小代讨回了公道。